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上海恒遠(yuǎn)生物科技發(fā)展有限公司是國(guó)內(nèi)首屈一指的elisa試劑盒營(yíng)銷商,先后為多家企業(yè)供貨,在生物科研行業(yè)里面去的的不錯(cuò)的成績(jī),為此回報(bào)社會(huì),從即日起,產(chǎn)品一律八折出售,歡迎你的來電。
在293 細(xì)胞中大量擴(kuò)增腺病毒
一旦重組病毒已被純化和鑒定,即可在293 細(xì)胞中進(jìn)行大量擴(kuò)增。本手冊(cè)提供了遞增培養(yǎng)規(guī)模和腺病毒感染周期的基本方法,按這一方法*終得到的病毒量約為3×1011~3×1012。由于一個(gè)細(xì)胞中所含的病毒顆粒為1000~10000,因此1L 培養(yǎng)細(xì)胞可得到約5×1012 病毒顆粒。如果要把病毒用氯化銫梯度離心純化,則必須至少3×108 的細(xì)胞,這樣才能正確分辨出病毒帶。對(duì)于蛋白表達(dá),則根據(jù)需要可在任何一步擴(kuò)增步驟中停止,離心沉淀細(xì)胞后按照適當(dāng)?shù)牟僮鞣椒ㄟM(jìn)行蛋白抽提(根據(jù)蛋白類型的不同抽提上清或細(xì)胞沉淀)。為優(yōu)化時(shí)間進(jìn)程,每個(gè)感染周期必須與下一次細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)同步。如果由于各種原因不能同步,則必須將病毒凍存,直至下一次細(xì)胞培養(yǎng)開始后再融化病毒。注意每次擴(kuò)增都將會(huì)剩下一些病毒,這些病毒先不必丟棄,以便下一步擴(kuò)增失敗時(shí)備用。每次擴(kuò)增都用代的病毒顆粒,這樣產(chǎn)生突變型病毒的可能性會(huì)大大降低。
操作步驟:
1 在100mm 培養(yǎng)皿或75cm2 培養(yǎng)瓶中加入10ml DMEM5%培養(yǎng)5×106 293 細(xì)胞。
2 取0.5ul 首次擴(kuò)增的病毒保存液,加入DMEM5%至1ml,混勻,這樣稀釋得到的MOI 值約為5。
3 移去培養(yǎng)液,小心加入病毒混合液,切勿破壞細(xì)胞單層,十字形慢慢晃動(dòng)3 次,37℃ CO2 孵箱中培養(yǎng)90 分鐘。
4 加入9ml DMEM5%。
5 再培養(yǎng)72 小時(shí),這時(shí)在10ml 溶液中大約有5×109~5×1010 個(gè)病毒顆粒,進(jìn)行MOI 測(cè)定以估計(jì)病毒顆粒。
注:如果此時(shí)得到的病毒量已足夠,可立即進(jìn)行病毒滴度測(cè)定。收集細(xì)胞,600×g 離心5 分鐘沉淀細(xì)胞,去上清后加入*小體積(一般為原始體積的1/10 即1ml)病毒保存溶液重懸細(xì)胞。-200C /370C 凍融3 次,臺(tái)式離心機(jī)上以速率離心去除細(xì)胞碎片,收集上清,然后進(jìn)行病毒滴定。
1 -20℃/37℃凍融3 次。
2轉(zhuǎn)入15ml 無菌離心管中,臺(tái)式離心機(jī)上以速率離心10 分鐘,收集上清凍存于-20 ℃或-80 ℃。
3 3 個(gè)175cm2 培養(yǎng)瓶中各加入107 293 細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。
4 將3ml 細(xì)胞裂解液上清加入12ml DMEM5%中,混勻。移去細(xì)胞培養(yǎng)液,每瓶小心加入5ml 混合液,十字形慢慢晃動(dòng)混勻3 次,370C 5%CO2 孵箱中培養(yǎng)90 分鐘。此時(shí)MOI 值約為25。
5 加入DMEM5%至30ml。
6 再培養(yǎng)48~72 小時(shí)。此時(shí)10ml 培養(yǎng)液病毒量約為3×1010~3×1011。若需要,進(jìn)行MOI 測(cè)定以估計(jì)病毒滴度。
注:如果此時(shí)病毒量已可以滿足實(shí)驗(yàn)所需,則可立即進(jìn)入病毒滴定步驟。600×g 離心5 分鐘收集細(xì)胞,棄上清,加入1/10 原始體積的溶液重懸細(xì)胞。-200C /370C 凍融3 次,臺(tái)式離心機(jī)上以速率沉淀細(xì)胞碎片,收集上清,進(jìn)行病毒滴定。
12. 移入50ml 離心管中,臺(tái)式離心機(jī)上速率離心10 分鐘,取出上清保存。
13. 30 瓶175 cm2 培養(yǎng)瓶中每瓶各加入107 293 細(xì)胞。
14. 將45ml 細(xì)胞裂解液上清加入105ml DMEM5%混勻,從培養(yǎng)瓶中移去培養(yǎng)液,加入5ml 混合液感染細(xì)胞,十字形緩慢晃動(dòng)3 次混勻,370C 培養(yǎng)90 分鐘。此時(shí)MOI 值約為25。
15. 加入DMEM5%至30ml/瓶。
16. 再培養(yǎng)48-72 小時(shí),此時(shí)約有3×1011~3×1012 個(gè)病毒。若需要,進(jìn)行MOI 測(cè)定估計(jì)病毒滴度。
如果要收集病毒顆粒,先收集被感染細(xì)胞,然后重懸在5ml DMEM5%中。-200C /370C 凍融3 次,離心沉淀細(xì)胞碎片。此時(shí)5ml DMEM5%中3×1011~3×1012 個(gè)病毒顆粒,濃度為6×1010~6×1011vp/ml。然后測(cè)定病毒滴度,或者用標(biāo)準(zhǔn)的氯化銫密度梯度離心法純化病毒。
在109 細(xì)胞中擴(kuò)增病毒可獲得大量病毒保存液,而在1010 細(xì)胞中擴(kuò)增則有一定技術(shù)性。切勿將擴(kuò)增后的病毒保存液再用來感染細(xì)胞,因這會(huì)大大增加RCA 產(chǎn)生量。有時(shí)不得不使用純化空斑以可能降低RCA 產(chǎn)量。如果已沒有純化的空斑,那么就不得不重新空斑純化重組病毒,鑒定克隆后再進(jìn)行擴(kuò)增。如果需要大于擴(kuò)增4 輪后的病毒量,注意請(qǐng)用早期的病毒作為擴(kuò)增源。比如,用第2 代病毒產(chǎn)生第3 代病毒。如果沒有第2 代病毒,那么必須用第1 代病毒來產(chǎn)生新的第2 代病毒。按這個(gè)原則進(jìn)行擴(kuò)增可使RCA 水平盡可能低。
如果用于表達(dá)蛋白,則可以收集細(xì)胞后根據(jù)蛋白特點(diǎn)選擇適當(dāng)方法抽提蛋白。細(xì)胞沉淀中一般可提取1-5mg 蛋白,建議在小規(guī)模擴(kuò)增后先測(cè)定感染后抽提蛋白的*佳時(shí)間,然后再大量擴(kuò)增蛋白。
腺病毒擴(kuò)增
代 | 第二代 | 第三代 | 第四代 | |
每瓶細(xì)胞數(shù) | 1×105 | 5×106 | 1×107 | 1×107 |
培養(yǎng)瓶大。╟m2) |
| 75 | 175 | 175 |
培養(yǎng)瓶數(shù) | 24 孔板1 孔 | 1 | 3 | 30 |
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| 首次擴(kuò)增后的病 |
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感染來源 | 稀釋的空斑 |
| 第二代病毒 | 第三代病毒 |
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| 毒保存液 |
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| 0.5 mL 或 |
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每瓶接種量 | 0.1 mL |
| 1 mL | 1.5 mL |
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| 2.5×107 |
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總培養(yǎng)體積 | 1 mL | 10 mL | 90 mL | 900 mL |
MOI | 0.01 | 5 | 25 | 25 |
滴度(VP/mL) | 1×108~9 | 5×108~9 | 3.3×108~9 | 3.3×108~9 |
總病毒量 | 1×108~9 | 5×109~10 | 3×1010~11 | 3×1011~12 |
原創(chuàng)作者:上海恒遠(yuǎn)生物技術(shù)發(fā)展有限公司
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