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技術(shù)文章

重組腺病毒構(gòu)建,擴(kuò)增及純化基本技術(shù)操作

點(diǎn)擊次數(shù):15315   發(fā)布時間:2012/9/26 14:01:54

重組腺病毒構(gòu)建,擴(kuò)增及純化基本技術(shù)操作

(細(xì)菌內(nèi)同源重組AdEasy System

 

目的基因的克。ㄒpshuttle-CMV質(zhì)粒為例)

1.      選擇適當(dāng)酶切位點(diǎn),進(jìn)行酶切連接,將目的片段插入pshuttl-CMV質(zhì)粒多克隆位點(diǎn)。

2.      重組質(zhì)粒鑒定: 酶切鑒定或測序。

3.      重組質(zhì)粒擴(kuò)增,純化并準(zhǔn)備適量含目的基因的穿梭質(zhì)粒。

4.      用PmeI單酶切線性化重組穿梭質(zhì)粒,電泳鑒定質(zhì)粒完全被切開。

5.      膠回收線性化質(zhì)粒,以備共轉(zhuǎn)化使用。

共轉(zhuǎn)化

1  大腸桿菌BJ5183電轉(zhuǎn)感受態(tài)制備

²       從新鮮瓊脂板上挑取單個BJ5183細(xì)菌,接種于LB培養(yǎng)基中,37℃振搖過夜。

²       接種25ml過夜培養(yǎng)物于500ml LB培養(yǎng)基,37℃振搖,至OD600 達(dá)到0.4。

²       迅速將培養(yǎng)物置于冰浴中30min,至充分冷卻。

²       將菌液轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的離心管中,4℃下以2500r/min離心15 min,棄培養(yǎng)液,回收細(xì)胞。

²       以10ml預(yù)冷的10%甘油洗滌沉淀,低溫離心,共兩次。

²       加約1ml(適量)預(yù)冷的10%甘油重懸沉淀,稀釋懸液100倍,測量OD600,至稀釋濃度為2-3×1010個細(xì)胞/ ml (1.0 OD600約2.5×1010個細(xì)胞/ml)。分裝,-80℃或液氮保存待用。

2  病毒骨架質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌,擴(kuò)增,純化。

3  將1-5µl (約1µg) 線性化的穿梭質(zhì)粒及1µl(約100ng/µl)病毒骨架質(zhì)粒(如pAdEasy-1)加入至含約40µl BJ5183電轉(zhuǎn)感受態(tài)的EP管中混勻,冰上冷卻。

4  將混合物加入電轉(zhuǎn)杯,電擊(1250-1500V/mm,5ms)。

5  電擊結(jié)束取出樣品,加入1ml SOC或LB培養(yǎng)液,37℃低速振蕩40min。

6  取適當(dāng)體積的電擊轉(zhuǎn)化細(xì)胞液涂于數(shù)個卡那霉素抗性平板(25-50mg/ml),37℃培養(yǎng)16-20hr。

7  次日挑取平板上長出的菌落(選擇*小的菌落),接種于3ml含25-50mg/ml的LB培養(yǎng)基,37℃培養(yǎng)10-15hr。

8  堿裂法提取質(zhì)粒,0.8%瓊脂糖凝膠電泳篩選,大質(zhì)粒為可能陽性克隆,進(jìn)一步酶切鑒定。以PacI單酶切,0.8%瓊脂糖凝膠電泳如顯示出一條大片段(約30kb),及一條小片段(約3.0或4.5kb)(同時可進(jìn)行其它酶切鑒定),則基本確定為陽性克隆。

9  取1-5µl 陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至DH5α大腸桿菌細(xì)胞(BJ5183為recA+,質(zhì)粒DNA易發(fā)生突變,DH5α或JM109,XL1-blue菌株為重組缺陷性菌株,可穩(wěn)定擴(kuò)增已鑒定的重組質(zhì)粒),擴(kuò)增細(xì)菌并純化質(zhì)粒。

重組病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)導(dǎo)293細(xì)胞

1  293細(xì)胞培養(yǎng):轉(zhuǎn)導(dǎo)24小時前,以方瓶為例,接種2×10293細(xì)胞于25cm2方瓶,使生長密度約50-70%。(也可以使用6孔或96孔板)

2  以PacI單酶切重組病毒質(zhì)粒(轉(zhuǎn)導(dǎo)25cm2方瓶約需4µgDNA),完全線性化后,乙醇沉淀,再以20 µl ddH2O溶解。

3  脂質(zhì)體包裹質(zhì)粒(以Lipofectamine為例):每4µg PacI約需20µl Lipofectamine包裹.質(zhì)粒及脂質(zhì)體分別稀釋于500µl無血清培養(yǎng)基再混合,置于室溫下15-30min。

4  以無血清培養(yǎng)基輕輕洗滌培養(yǎng)瓶,另加2.5ml無血清培養(yǎng)基,37℃放置10min。

5  將Lipofectamine-DNA混合物加入培養(yǎng)瓶,37℃孵箱放置4hr。

6  4hr后,棄Lipofectamine-DNA混合液,另加入6ml DMEM完全培養(yǎng)基(含10% FCS)。如有大量細(xì)胞漂浮,可不棄Lipofectamine-DNA液,加入6ml DMEM完全培養(yǎng)基,37℃孵育過夜,再換液。

7  培養(yǎng)過程中觀察細(xì)胞生長情況。約2周后可觀察到細(xì)胞病變(CPE)出現(xiàn)(如用pAdTrack-CMV質(zhì)粒,由于含GFP,可觀察到綠色熒光)。

重組病毒鑒定

1  轉(zhuǎn)導(dǎo)10-14d后,收集細(xì)胞沉淀,加入2ml滅菌的PBS混懸,凍融細(xì)胞,離心后收集上清保存于-80℃。

2  取30-50% 步驟1中上清,感染50-70%飽和度的25cm2方瓶中293細(xì)胞。2-3d后出現(xiàn)明顯細(xì)胞病變。

3  感染后3-5d,當(dāng)1/3-1/2細(xì)胞漂浮時收集病毒。按步驟1收集細(xì)胞并準(zhǔn)備病毒上清。通過Western blot和/或PCR鑒定重組腺病毒產(chǎn)生。

4  PCR鑒定重組病毒。取5µl病毒上清加入10µl蛋白酶K,55℃孵育1hr,再煮沸5min,離心后取1-2µl作PCR。

重組病毒擴(kuò)增,純化

1  75cm2方瓶中接種293細(xì)胞,至密度達(dá)到90%,加入適量病毒上清感染細(xì)胞。3-4d后,細(xì)胞幾乎變圓,且有一半細(xì)胞漂浮,則收集所有細(xì)胞。約500g轉(zhuǎn)速離心,棄上清。

2  以滅菌PBS重懸沉淀,反復(fù)凍融4次。4℃下7000g離心5min.病毒純化至少需要30瓶75cm2方瓶細(xì)胞。

3  CsCl連續(xù)梯度離心純化:50ml離心管中稱量4.4g CsCl,加入8ml病毒裂解上清液,混勻,體積約為10ml。轉(zhuǎn)移至12ml超速離心管(用于SW41轉(zhuǎn)頭)中,覆蓋約2ml礦物油。平衡后,10℃下32000 rpm離心18-24hr,用注射器抽吸離心出的病毒帶。

(也可CsCl不連續(xù)梯度離心:20ml超速離心管中緩慢加入8ml CsCl 1.4 (53 g + 87 mL 10 mM Tris-HCl,pH=7.9),上面小心加入6 mL CsCl 1.2 (26.8 g + 92 mL 10 mM Tris-HCl,pH=7.9),再小心加入病毒上清液至體積達(dá)到20ml。平衡后,4℃下 23000rpm離心90min (SW28轉(zhuǎn)頭),用注射器抽吸下層藍(lán)白色病毒帶)

4  病毒透析去鹽:配置透析液(10 mM Tris pH 8.0, 2 mM MgCl2, 5% sucrose),滅菌處理。4℃透析,更換3次透析液,可基本去除CsCl,病毒保存于-80℃。

病毒滴度測定(TCID50

1  細(xì)胞準(zhǔn)備:96孔板中接種100µl 293細(xì)胞,每孔細(xì)胞數(shù)約104個,以2% DMEM培養(yǎng)

2  稀釋病毒液準(zhǔn)備:以2% DMEM將病毒液稀釋成8個較高濃度(如10-3-10-10),每個濃度重復(fù)10個,每孔加入病毒稀釋液100µl。另留兩排不加病毒液作為陰性對照。37℃下,孵箱培養(yǎng)10天。

3  10d后觀察細(xì)胞,記數(shù)每排出現(xiàn)CPE的孔數(shù),計(jì)算細(xì)胞病變率。(如某一濃度各孔細(xì)胞全部病變,比率為1,如無細(xì)胞病變,則比率為0)。

4  計(jì)算T =10×101 + d (S - 0.5) /ml

d = Log 10 稀釋度(如為10倍稀釋℃,d=1)

   S = 各濃℃細(xì)胞病變比率之和

實(shí)驗(yàn)室重組腺病毒常用質(zhì)粒:病毒骨架質(zhì)粒:pAdEasy-1, pAdEasy-2

穿梭質(zhì)粒:p-Shuttle, p-Shuttle-CMV, pAdTrack, pAdTrack-CMV

原創(chuàng)作者:上海恒遠(yuǎn)生物技術(shù)發(fā)展有限公司

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