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點擊次數(shù):15702 發(fā)布時間:2012/10/12 17:11:16
1、目的:
1.1 了解噬菌體效價的含義及其測定原理。
1.2 學(xué)會檢查噬菌體的方法。
1.3 掌握用雙層瓊脂平板法測定噬菌體效價的操作技能。
2、原理:
噬菌體是一類專性寄生于細(xì)菌和放線菌等微生物的病毒,其個體形態(tài)極其微小,用常規(guī)微生物計數(shù)法無法測得其數(shù)量。當(dāng)烈性噬菌體侵染細(xì)菌后會迅速引起敏感細(xì)菌 裂解,釋放出大量子代噬菌體,然后它們再擴散和侵染周圍細(xì)胞,*終使含有敏感菌的懸液由混濁逐漸變清,或在含有敏感細(xì)菌的平板上出現(xiàn)肉眼可見的空斑──噬 菌斑。了解噬菌體的特性,快速檢查、分離,并進行效價測定,對在生產(chǎn)和科研工作中防止噬菌體的污染具有重要作用。
檢樣可以是發(fā)酵液、空氣、污水、土壤等(至于無法采樣而需檢查的對象,可以用無菌水浸濕的棉花涂拭表面作為檢查樣品)。為了易于分離可先經(jīng)增殖培養(yǎng),使樣品中的噬菌體數(shù)量增加。
采用生物測定法進行噬菌體檢查,約需12h左右,因而不能及時判斷是否有噬菌體污染。通過快速檢查可大致確定是否有噬菌體污染,以采取必要的防治措施。根 據(jù)正常發(fā)酵(培養(yǎng))液離心后菌體沉淀,上清液蛋白含量很少,加熱后仍然清亮;而侵染有噬菌體的發(fā)酵(培養(yǎng))液經(jīng)離心后其上清液中因含有自裂解菌中逸出的活 性蛋白,加熱后發(fā)生蛋白質(zhì)變性,因而在光線照射下出現(xiàn)丁達爾效應(yīng)而不清亮。此法簡單、快速,對發(fā)酵液污染噬菌體的判斷亦較準(zhǔn)確。但不適于溶源性細(xì)菌及溫合 噬菌體的診斷,對侵染噬菌體較少的一級種子培養(yǎng)液也往往不適用。
噬菌體的效價即1mL樣品中所含侵染性噬菌體的粒子數(shù)。效價的測定一般采用雙層瓊脂平板法。由于在含有特異宿主細(xì)菌的瓊脂平板上,一般一個噬菌體產(chǎn)生一個 噬菌斑,故可根據(jù)一定體積的噬菌體培養(yǎng)液所出現(xiàn)的噬菌斑數(shù),計算出噬菌體的效價。此法所形成的噬菌斑的形態(tài)、大小較一致,且清晰度高,故計數(shù)比較準(zhǔn)確,因 而被廣泛應(yīng)用。
3、材料:
3.1菌種:
敏感指示菌(大腸桿菌)、大腸桿菌噬菌體(從陰溝或糞池污水中分離)。
3.2培養(yǎng)基:
二倍肉膏蛋白胨培養(yǎng)液,上層肉膏蛋白胨半固體瓊脂培養(yǎng)基(含瓊脂0.7%,試管分裝,每管5mL),下層肉膏蛋白胨固體瓊脂培養(yǎng)基(含瓊脂2%),1%蛋白胨水培養(yǎng)基。
3.3儀器和器具:
無菌的試管、培養(yǎng)皿、三角瓶、移液管(1、5mL),恒溫水浴鍋,離心機、721分光光度計等。
4、流程:
4.1噬菌體的檢查
4.2噬菌體效價的測定
5、方法:
5.1 噬菌體的檢查:
5.1.1 樣品采集
將2~3g土樣或5mL水樣(如陰溝污水)放入滅菌三角瓶中,加入對數(shù)生長期的敏感指示菌(大腸桿菌)菌液3~5mL,再加20mL二倍肉湯蛋白胨培養(yǎng)液。
5.1.2 增殖培養(yǎng)
30℃振蕩培養(yǎng)12~18h, 使噬菌體增殖。
5.1.3 離心分離
將上述培養(yǎng)液以3000rpm離心15~20min, 取上清液,用pH7.0,1%蛋白胨水稀釋至10-2~10-3,用于噬菌體檢查及效價測定。
5.1.4 生物測定法
5.1.4.1雙層瓊脂平板法
5.1.4.1.1 倒下層瓊脂
融化下層培養(yǎng)基,倒平板(約10mL/皿)待用。
5.1.4.1.2倒上層瓊脂
融化上層培養(yǎng)基,待融化的上層培養(yǎng)基冷卻至50℃左右時,每管中加入敏感指示菌 (大腸桿菌) 菌液0.2mL,待檢樣品液或上述噬菌體增殖液0.2~0.5mL,混合后立即倒入上層平板鋪平。
5.1.4.1.3恒溫培養(yǎng)
30℃恒溫培養(yǎng)6~12h觀察結(jié)果。
5.1.4.1.4 觀察結(jié)果
如有噬菌體,則在雙層培養(yǎng)基的上層出現(xiàn)透亮無菌圓形空斑──%26not;%26not;%26not;%26not;噬菌斑。
5.1.4.2 單層瓊脂平板法
省略下層培養(yǎng)基,將上層培養(yǎng)基的瓊脂量增加至2%,融化后冷卻至45℃左右,如同上法加入指示菌和檢樣,混合后迅速倒平板。30℃恒溫培養(yǎng)6~16h后觀察結(jié)果。
5.1.5 離心分離加熱法(快速檢查)
取大腸桿菌正常培養(yǎng)液和侵染有噬菌體的異常大腸桿菌培養(yǎng)液,4000rpm離心20min,分別取兩組發(fā)酵液的上清液(A1),一部分于721分光光度計上測定OD650光密度值,另外各取5mL上清液于試管中,置水浴中煮沸2min(A2),檢測A2溶液OD650光密度值,記錄結(jié)果。
5.2 噬菌體效價的測定:
5.2.1 倒平板
將融化后冷卻到45℃左右的下層肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基傾倒于11個無菌培養(yǎng)皿中,每皿約傾注10mL培養(yǎng)基,平放,待冷凝后在培養(yǎng)皿底部注明噬菌體稀釋度。
5.2.2 稀釋噬菌體
按10倍稀釋法,吸取0.5mL大腸桿菌噬菌體,注入一支裝有4.5mL1%蛋白胨水的試管中,即稀釋到10-1,依次稀釋到10-6稀釋度。
5.3 噬菌體與菌液混合:
將11支滅菌空試管分別標(biāo)記10-4、10-5、10-6和對照。分別從10-4、10-5和10-6噬菌體稀釋液中吸取0.1mL于上述編號的無菌試管 中,每個稀釋度平行做三個管,在另外兩支對照管中加0.1mL無菌水,并分別于各管中加入0.2mL大腸桿菌菌懸液,振蕩試管使菌液與噬菌體液混合均勻, 置37℃水浴中保溫5min,讓噬菌體粒子充分吸附并侵入菌體細(xì)胞。
5.4 接種上層平板:
將11支融化并保溫于45℃的上層肉膏蛋白胨半固體瓊脂培養(yǎng)基5mL分別加入到含有噬菌體和敏感菌液的混合管中,迅速搓勻,立即倒入相應(yīng)編號的底層培養(yǎng)基平板表面,邊倒入邊搖動平板使其迅速地鋪展表面。水平靜置,凝固后置37℃培養(yǎng)。
5.5 觀察并計數(shù):
觀察平板中的噬菌斑,并將結(jié)果記錄于 計算公式:N=Y/V%26#8226;X
(N:效價值,Y:平均噬菌斑數(shù)/皿,V:取樣量,X:稀釋度)
例如:當(dāng)稀釋度為10-6時,取樣量為0.1 mL/皿,同一稀釋度中3個平板上的噬菌斑的平均值為186個,則該樣品的效價為:N=186/0.1%26#215;10-6=1.86%26#215;109。
6、結(jié)果:
6.1、噬菌體檢查
6.1.1離心分離加熱法
處理方法OD650光密度值
正常發(fā)酵液(對照) 異常發(fā)酵液(試驗)
離心上清液(A1)
離心上清液加熱煮沸后(A2)
A2/A1
6.1.2 繪出平板上的噬菌斑檢測結(jié)果,指出噬菌斑和宿主細(xì)菌。
6.2、噬菌體效價測定
6.2.1 平板上噬菌斑數(shù)目
噬菌體稀釋度10-4、10-5、10-6 對照
噬菌斑數(shù)(個)/皿
平均每皿噬菌斑數(shù)目
6.2.2 計算噬菌體效價(即噬菌斑形成單位pfu, plague-forming unit).
原創(chuàng)作者:上海恒遠(yuǎn)生物技術(shù)發(fā)展有限公司
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