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腺病毒的包裝，純化和感染
技術(shù)背景：Adeasy 系統(tǒng)利用了腺病毒具有的高感染能力，可高度濃縮等優(yōu)點，
并破壞了腺病毒基因組中的早期基因E1，使之成為較為安全、高效的病毒載體。
利用帶有E1 基因的293 細(xì)胞作為包裝細(xì)胞，通過倍比擴增，富集病毒顆粒，并
通過CsCl 梯度離心，透析進(jìn)行分離純化。對絕大多數(shù)的細(xì)胞株可以達(dá)到近乎100
％的感染效率。但需要指出的是Adeasy 同樣具有所有病毒載體或轉(zhuǎn)染試劑都不
可避免的細(xì)胞毒性問題。
所需試劑：
 293 細(xì)胞；
 重組好的腺病毒質(zhì)粒；
 Pac I 限制性內(nèi)切酶；
 質(zhì)粒回收相關(guān)試劑；
 細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染相關(guān)試劑；
 TBS：10mM Tris, 0.9% NaCl, pH8.1;
 40% CsCl：28.45 g CsCl 溶于42.7 ml 的TBS 中，4 度保存；
 15% CsCl：9.085 g CsCl 溶于47.69 ml 的TBS 中，4 度保存；
 Beckman 離心管：14*89 mm，SW41 轉(zhuǎn)頭；
 Polybrene （sigma），10 mg/ml；
 透析袋：Spectrum Co. （成卷供應(yīng)，帶少量甘油，硫化物與重金屬），
MW=8000~14400；
 滅菌甘油。
操作流程：
1. 293 細(xì)胞（E1-transformed human embryonic kidney cells 在轉(zhuǎn)染前24 小時接種
于1 或2 個60 mm 培養(yǎng)盤中，使之在轉(zhuǎn)染時細(xì)胞匯合率為50-70%；
2. 在轉(zhuǎn)染前，用Pac I 處理目的質(zhì)粒（一般一個60 mm 細(xì)胞盤需要6μg DNA）。
處理后質(zhì)粒用乙醇沉淀并重懸于20 μl 無菌水中；
3. 用PEI 或其他轉(zhuǎn)染試劑將6 μg Pac I 處理過的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞；
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4. 8 個小時后移去混合液，加入4 ml DMEM 完全培養(yǎng)液（10% CBS，1%
Pen/Strep）；
5. 在轉(zhuǎn)染后7 到10 天用細(xì)胞刮（而不是胰酶）將細(xì)胞從瓶中刮下并移入50ml
錐形管。離心后將細(xì)胞重懸于2.0 ml PBS 或全培液中。于液氮中凍結(jié)細(xì)胞，
37℃水浴中溶解，劇烈振蕩。此步驟共進(jìn)行4 次。注意保存時不要反復(fù)凍融，
可保存于-20℃；
6. 將293 細(xì)胞以50-70%的匯合率鋪于60 mm 培養(yǎng)盤中，以30-50%的體積比加
入含病毒上清液。在感染后2-3 天即可看到明顯的細(xì)胞裂解或CPE 現(xiàn)象；
7. 在有1/3 到1/2 的細(xì)胞脫離漂浮時，通常是感染后3-5 天收集病毒�？蛇M(jìn)一
步通過Western blot 或PCR（5 μl 病毒上清加上10 μl PCR-grade Protease K，
55℃消化1 小時，然后煮沸樣品5 min，離心后取1-2 μl 進(jìn)行PCR 反應(yīng)）證
實重組腺病毒的存在；
8. 按步驟5 的方法收集病毒上清。在這種情況下一般至少可收集到107 infectious
particles/ml 的病毒。每輪的擴增應(yīng)能提高一個數(shù)量級的梯度；
9. 為了進(jìn)一步擴增，將步驟8 獲得的病毒上清進(jìn)一步感染100 mm 培養(yǎng)盤的細(xì)
胞，按步驟5 的方法收集病毒，并進(jìn)而將其感染150 mm 細(xì)胞培養(yǎng)盤中的293
細(xì)胞，以獲得足夠量的病毒；
10. 將15% CsCl 和40% CsCl 加入Beckman 離心管中制備CsCl 梯度溶液；
11. 將*終富集病毒顆粒的病毒上清滴加于CsCl 梯度溶液上；
12. 超速離心，30000 rpm，4 度離心16 個小時；
13. 離心后，應(yīng)有兩條帶。位置較高，顏色較弱的條帶主要為腺病毒空殼，不具
感染能力；位置較低，顏色較亮的條帶含有我們需要收集的活病毒顆粒。用
16 號針頭將這一條帶收集；
14. 在TBS 中透析一小時，隨后在含有10％甘油的TBS 中透析兩次，每次一小
時；
15. 將純化的腺病毒分裝于EP 管中；
16. 在Eppendorf Biophotometer 中測量透析液中的總蛋白量，1μg 病毒蛋白相當(dāng)
于4×109 病毒顆粒；
17. 長期保存于-70 度中，短期可保存于4 度，切忌反復(fù)凍溶；
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18. 由于腺病毒對不同細(xì)胞株的感染效率存在差異，且考慮到病毒顆粒的細(xì)胞毒
副作用，通常通過梯度感染的方法確定所需的病毒用量。以相對細(xì)胞數(shù)1：1，
10：1，100：1，1000：1 的病毒顆粒感染靶細(xì)胞；加入相對培養(yǎng)液體積1：
1000 的Polybrene。在37 度下平板離心30 分鐘；
19. 感染8~12 小時后換液。將含有病毒的培養(yǎng)液小心移入含有消毒液的廢液缸
中，加入適量全培液。

原創(chuàng)作者：上海恒遠(yuǎn)生物技術(shù)發(fā)展有限公司