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點擊次數(shù):15195 發(fā)布時間:2013/3/29 11:32:29
1. 細胞培養(yǎng)(HEK293T)
1) 顯微鏡下觀察細胞,細胞生長狀態(tài)良好,去上清;
2) 加入預(yù)熱的PBS 3ml, 溫柔地清洗細胞,棄去PBS;
3) 用胰蛋白酶消化細胞,通常75cm2 培養(yǎng)瓶的貼壁細胞用3ml 胰蛋白酶于37oC
處理5min;
4) 待細胞脫落后,加入5ml DMEM 培養(yǎng)液(含10%FBS)以終止消化反應(yīng),并將
細胞懸液轉(zhuǎn)移入15ml 或50ml 離心管中;
5) 1000rpm 離心5min,去除上清;
6) 加入10ml DMEM 培養(yǎng)液(含10%FBS),重新懸浮細胞,使細胞充分打散;
7) 進行細胞計數(shù),(4 個大方格細胞數(shù)的均值×104 個為每ml 所含細胞數(shù));
8) 根據(jù)細胞計數(shù)結(jié)果,將適當(dāng)數(shù)量的細胞懸液轉(zhuǎn)接入含有新鮮培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶
或皿中;(第二天做轉(zhuǎn)染,A.Fugene6 法--細胞總量應(yīng)達4-5×106 /10cm 培養(yǎng)
皿; B. 磷酸鈣法: 細胞總量應(yīng)達3×106 / 10cm 培養(yǎng)皿);
9) 置于37 ℃ 5%CO2 的培養(yǎng)箱中培養(yǎng) (注意培養(yǎng)箱應(yīng)有足夠的水分)。
注:以上所使用的胰蛋白酶、培養(yǎng)液等在使用前都置于37℃水浴中預(yù)熱,以減
小對細胞的刺激。
2. 細胞轉(zhuǎn)染
2.1 脂質(zhì)體介導(dǎo)的貼壁細胞轉(zhuǎn)染法
以下針對293T 細胞、10cm 培養(yǎng)皿
目前主要使用試劑盒為Roche 公司的FuGENETM6 Transfection Reagent
1) 轉(zhuǎn)染前24 小時以4-5×106 /10cm 培養(yǎng)皿的細胞總量鋪板,當(dāng)細胞生長狀態(tài)
原創(chuàng)作者:上海恒遠生物技術(shù)發(fā)展有限公司
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