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點擊次數(shù):15240 發(fā)布時間:2013/4/8 11:57:20
蛋白質(zhì)組學(xué)即定量研究蛋白質(zhì)表達水平的變化,其在生命科學(xué)各領(lǐng)域的應(yīng)用極為廣泛。進行雙向凝膠蛋白電泳或蛋白質(zhì)譜分析的基礎(chǔ)就是確保獲得高質(zhì)量的總蛋白提取物。本專題就這個問題,列舉一種常用、可信的植物總蛋白提取方法。
(一) 初步處理(大概需要8 h)
1. 樣品處理
選取無菌培養(yǎng)下的植物組織、懸浮培養(yǎng)的植物細胞,滅菌濾紙吸取多余水分。精確稱重2 g用于以下的操作。
2. 液氮冷凍研磨
將精確稱量的細胞材料置于中號研缽中,淋入少量液氮(淹沒細胞材料為宜)。待液氮揮發(fā)后,迅速研磨。若出現(xiàn)細胞材料變濕跡象,則再次淋入少量液氮進行冷凍。如此反復(fù)2~3次,即可獲得呈干燥粉末狀態(tài)的細胞材料。
3. 用50%三(TCA)和等體積2%交聯(lián)聚維酮(PVPP)混合攪拌使之與細胞粉充分接觸, 置于冰上 1 h。
(以下操作均在4℃條件下進行)
4. 15300 g 離心30 min,棄去上清液,留下沉淀。
5.清洗沉淀(大約需要4 h)
(1) 加入50% TCA,搖勻,15300 g 離心30 min,棄上清液。該操作進行一次。
(2) 加入24% TCA,搖勻,15300 g 離心20 min,棄上清液。該操作進行兩次。
(3) 加入10% TCA,搖勻,15300 g 離心20 min,棄上清液。該操作進行一次。
(4) 加入乙酸乙酯:乙醇(1:2),搖勻,15300 g 離心20 min,棄上清液。該操作進行兩次。
(5) 用80%丙酮,搖勻,15300 g 離心30 min,棄上清液。該操作進行一次。
(6) 4℃干燥沉淀。
6.加3倍量石英砂,細研。
7.用預(yù)冷的50%TCA沖洗,然后再用預(yù)冷的丙酮沖洗兩次,4℃干燥。
1. 丙酮,乙酸乙酯,乙醇,純水,EDTA鈉鹽,三(TCA),交聯(lián)聚維酮(PVPP),三氟乙烯(TFE),脫氧膽酸鈉DOCX,碳酸氫銨,二硫蘇糖醇(DTT)
2. 4-(2-aminoethyl) benzenesulfonyl fluoride; E-64, 肽酶抑制劑bestatin, 亮抑肽酶leupeptin, 抑肽酶
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原創(chuàng)作者:上海恒遠生物技術(shù)發(fā)展有限公司
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