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點(diǎn)擊次數(shù):15103 發(fā)布時(shí)間:2013/7/31 9:01:28
“elisa試劑盒”常見的問題及解答
問:抗原檢測(cè)出的分子量比資料上的大,是怎么回事?
答:a)抗原形成了二聚體。增多巰基乙醇量,煮沸變性時(shí)間延長(zhǎng),可以打開二聚體。b)蛋白本身的修飾如:糖基化,磷酸化等
問:蛋白轉(zhuǎn)移不到膜上,但膠上有,同時(shí)Marker 轉(zhuǎn)上去了,為什么?
答:可能是:a)樣品濃度過低;b)轉(zhuǎn)移時(shí)間不夠,。
問:磷酸化抗體的檢測(cè)樣本制備時(shí)是否一定要加NaF等?
答:NaF是一種廣譜磷酸化酶的抑制劑,一般加。但是不加也可以,大部分時(shí)候是不用加的。
問:要驗(yàn)證某個(gè)細(xì)胞上有無該蛋白的存在,需要做免疫組化和western blot試驗(yàn)嗎?做這兩個(gè)試驗(yàn)時(shí)的一抗和二抗可以共用嗎?
答:①免疫組化可以用來進(jìn)行定位,但是不能精確定量,而且有時(shí)會(huì)有假陽性,不易與背景區(qū)分;Western blot可以特異性檢測(cè)某個(gè)蛋白質(zhì)分子,進(jìn)行定量,但是不能定位。
②兩種實(shí)驗(yàn)的一抗有時(shí)候不能通用,公司的產(chǎn)品說明一般都會(huì)說明可以進(jìn)行什么實(shí)驗(yàn),在免疫組化時(shí),是否適合石蠟切片或者冰凍切片。
問:做Western Blot時(shí),提取蛋白后凍存(未加蛋白酶抑制劑),用的博士德的一抗,開始還有點(diǎn)痕跡,現(xiàn)在越來越差,上樣量已加到120μg,換了個(gè)santa cloz的一抗仍不行。是什么原因?蛋白酶抑制劑單加PMSF行嗎?
答:懷疑是樣品問題,可能是:1,樣品不能反復(fù)凍融;2,樣品未加蛋白酶抑制劑。同時(shí),建議檢查Western Blot過程,提高一抗?jié)舛取?duì)于加蛋白酶抑制劑來說,一般加PMSF就可以了,能多加幾中種蛋白酶抑制劑。
問:細(xì)胞水平要做western blot,多少細(xì)胞提的蛋白夠做western blot?
答:一般5×10^6就足夠了
問:同一樣品能同時(shí)提RNA又提蛋白么?這樣對(duì)western blot有無影響?
答:能,沒有問題。
問:同一蛋白樣品能同時(shí)進(jìn)行兩種因子的Western Blot檢測(cè)嗎?
答:當(dāng)然可以,有的甚至可以同時(shí)測(cè)幾十種樣品。
問:如果目標(biāo)蛋白是膜蛋白或是胞漿蛋白,操作需要注意什么?
答:如果是膜蛋白和胞漿蛋白,所用的去垢劑要溫和得多,這時(shí)加上NaF去抑制磷酸化酶的活性。
問:我的樣品的蛋白含量很低,每微升不到1微克,但是在轉(zhuǎn)膜時(shí)經(jīng)常會(huì)發(fā)現(xiàn)只有一部分蛋白轉(zhuǎn)到了膜上,就是在轉(zhuǎn)膜后染膠發(fā)現(xiàn)有的孔所有的蛋白條帶都在,只是顏色變淡了,有什么辦法可以解決?
答:你可以加大上樣量,沒有問題,還有轉(zhuǎn)移時(shí)你可以用減少電流延長(zhǎng)時(shí)間,加20%甲醇。
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