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Western Blot轉(zhuǎn)膜步驟

點(diǎn)擊次數(shù):15228   發(fā)布時(shí)間:2013/9/18 10:41:29

Western Blot轉(zhuǎn)膜步驟

免疫印跡(immunoblotting)又稱蛋白質(zhì)印跡(western blot),它是根據(jù)抗原抗體的特異性結(jié)合檢測(cè)復(fù)雜樣品中的某種蛋白的方法。western blot是在凝膠電泳和固相免疫測(cè)定技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種新的免疫生化技術(shù)。由于免疫印跡(western blot)具有SDS-PAGE的高分辨力和固相免疫測(cè)定的高特異性和敏感性,現(xiàn)已成為蛋白分析的一種常規(guī)技術(shù)。免疫印跡(western blot)常用于鑒定某種蛋白,并能對(duì)蛋白進(jìn)行定性和半定量分析。

主要實(shí)驗(yàn)步驟如下:

1. 蛋白質(zhì)抽提

實(shí)驗(yàn)對(duì)象為組織樣品,取適量(250~500mg)新鮮組織樣品或正確保存的組織樣品,加1ml含蛋白酶抑制劑的總蛋白抽提試劑(或核蛋白抽提試劑),勻漿后抽提總蛋白(或核蛋白)。

實(shí)驗(yàn)對(duì)象為細(xì)胞樣品,每份樣品取1×106~1×107細(xì)胞,PBS清洗細(xì)胞,去PBS加0.1ml~1ml含蛋白酶抑制劑的總蛋白抽提試劑(或核蛋白抽提試劑)抽提總蛋白(或核蛋白)。

2. 蛋白質(zhì)定量:按BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒操作說(shuō)明操作,測(cè)定樣品濃度。

3. 變性聚丙烯酰胺不連續(xù)凝膠電泳(SDS-PAGE):將準(zhǔn)備好的樣品液和預(yù)染蛋白marker分別上樣,標(biāo)準(zhǔn)加進(jìn)個(gè)孔中,電泳分離蛋白。

4. 蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜,按Bio-Rad蛋白轉(zhuǎn)移裝置說(shuō)明組裝濾紙凝膠纖維素夾層,30mA恒流條件下,4°C轉(zhuǎn)移過(guò)夜。

5. western blot膜的封閉和抗體孵育

膜在5%脫脂奶粉溶液中室溫孵育1小時(shí)以封閉膜上的非特異結(jié)合。

封閉過(guò)的膜加入一抗室溫孵育1.5小時(shí),抗原抗體結(jié)合。

加入HRP標(biāo)記的二抗體以結(jié)合一抗,室溫孵育膜1小時(shí)。加入HRP標(biāo)記的GAPDH抗 體可同時(shí)檢測(cè)GAPDH含量。

6. western blot結(jié)果檢測(cè):化學(xué)發(fā)光法檢測(cè),膜與化學(xué)發(fā)光底物孵育,經(jīng)X膠片曝光顯 影。圖片掃描保存為電腦文件,并用GIS1000分析軟件將圖片上每個(gè)特異條帶灰度值的數(shù)字化。

7. western blot數(shù)據(jù)分析:目的蛋白的灰度值除以內(nèi)參GAPDH/Actin的灰度值以校正誤差,所得結(jié)果代表某樣品的目的蛋白相對(duì)含量。

8. 提供實(shí)驗(yàn)報(bào)告,包括詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)方法及免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果的相關(guān)數(shù)據(jù)。

 
 

 

原創(chuàng)作者:上海恒遠(yuǎn)生物技術(shù)發(fā)展有限公司

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