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技術文章

紙層析法:分離鑒定氨基酸實驗

點擊次數:15917   發(fā)布時間:2013/9/22 17:00:50

紙層析法是生物化學上分離、鑒定氨基酸混合物的常用技術,可用于蛋白質的氨基酸成分的定性鑒定和定量測定。本文主要介紹了紙層析法分離鑒定氨基酸的實驗原理、器材和具體操作步驟。
 

紙層析法:分離鑒定氨基酸實驗
紙層析法

一、目的

通過氨基酸的分離,學習紙層析法的基本原理及操作方法。

二、原理

紙層析法是用濾紙作為惰性支持物的分配層析法。

層析溶劑由有機溶劑和水組成。

物質被分離后在紙層析圖譜上的位置是用Rf 值(比移)來表示的:

R=原點到層析點中心的距離

原點到溶劑前沿的距離

在一定的條件下某種物質的Rf 值是常數。Rf 值的大小與物質的結構、性質、溶劑系統、層析濾紙的質量和層析溫度等因素有關。本實驗利用紙層析法分離氨基酸。

三、器材

1、層析缸① 2、毛細管3、噴霧器4、培養(yǎng)皿

5、層析濾紙(新華一號)

四、試劑

1、擴展劑

是4 份水飽和的正丁醇和1 份醋酸的混合物。將20mL 正丁醇和5mL 冰醋酸放入分液漏斗中,與15mL 水混合,充分振蕩,靜置后分層,放出下層水層。取漏斗內的擴展劑約5mL 置于小燒杯中做平衡溶劑,其余的倒入培養(yǎng)皿中備用.

2、氨基酸溶液0.5%的賴氨酸、脯氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸溶液及它們的混合液(各組份濃度均為0.5%)。各5mL

3、顯色劑50~100mL

0.1%水合茚三銅正丁醇容液。

五、操作

1、將盛有平衡溶劑的小燒杯置于密閉的層析缸中。

2、取層析濾紙(長22cm、寬14cm)一張。在紙的一端距邊緣2~3cm處用鉛筆劃一條直線,在此直線上第間隔2cm 作一記號如右圖。

3、點樣用毛細管將各種氨基酸樣品分別點在這6 個位置上,干后再點一次。每點在紙上擴散的直徑不超過3mm。

4、擴展用線將濾紙縫成筒狀,紙的兩邊不能接觸。將盛有約20mL擴展劑的培養(yǎng)皿建迅速置于密閉的層析缸中,并將濾紙直立于培養(yǎng)皿中(點樣的一端在下,擴展劑的液面需你于點樣線1cm)。待溶劑上升15~20cm 時即取出濾紙,自然干燥或用吹風機熱風吹干。

5、顯色用噴霧器均勻噴上0.1%茚三酮正丁醇溶液,然后置烘箱中烘烤5 分鐘(100℃)或用熱風吹干即可顯出各層析斑點。

6、計算各種氨基酸的Rf 值。

原創(chuàng)作者:上海恒遠生物技術發(fā)展有限公司

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