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點(diǎn)擊次數(shù):15434 發(fā)布時間:2013/11/20 9:26:36
一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/strong>
1、深入了解elisa法測定抗體效價的原理。
2、掌握ELISA法測定單克隆抗體效價的方法。
間接ELISA效價圖
二、實(shí)驗(yàn)原理
ELISA是以免疫學(xué)反應(yīng)為基礎(chǔ),將抗原、抗體的特異性反應(yīng)與酶對底物的高效催化作用相結(jié)合起來的一種敏感性很高的試驗(yàn)技術(shù)。免疫酶技術(shù)是將酶標(biāo)記在抗體/抗原分子上,形成酶標(biāo)抗體/酶標(biāo)抗原,稱為酶結(jié)合物。該酶結(jié)合物的酶在免疫反應(yīng)后,作用于底物使之呈色,根據(jù)顏色的有無和深淺,定位或定量抗原/抗體。ELISA法是免疫酶技術(shù)的一種,其特點(diǎn)是利用聚苯乙烯微量反應(yīng)板(或球)吸附抗原/抗體,使之固相化,免疫反應(yīng)和酶促反應(yīng)都在其中進(jìn)行。在每次反應(yīng)后都要反復(fù)洗滌,這既保證了反應(yīng)的定量關(guān)系,也避免了末反應(yīng)的游離抗體/抗原的分離步驟。在ELISA法中。酶促反應(yīng)只進(jìn)行一次,而抗原、抗體的免疫反應(yīng)可進(jìn)行一次或數(shù)次,即可用二抗(抗抗體)、三抗再次進(jìn)行免疫反應(yīng)。
目前常用的幾種ELISA方法有:測定抗體的間接法,測定抗原的雙抗體夾心法和測定抗原的競爭法等。本實(shí)驗(yàn)采用間接法測定單克隆抗體效價。其主要過程為:首先將已知定量抗原吸附在聚苯乙烯微量反應(yīng)板的凹孔內(nèi),加待測抗體,保溫后洗滌以除去未結(jié)合的雜蛋白質(zhì),加酶標(biāo)抗抗體,保溫后洗滌,加底物保溫30分鐘后,加酸或堿終止酶促反應(yīng),用目測或光電比色測定抗體含量。
三、儀器、原料和試劑
儀器
聚苯乙烯96孔酶標(biāo)板、微量移液管、酶聯(lián)免疫閱讀儀、水浴鍋。
原料
單克隆抗體
試劑
1、抗原及酶標(biāo)記抗體
①抗原:兔抗人IgG(RabbitAanti-humanIgG,CodeNo.A0423);
②酶標(biāo)抗抗體:兔抗鼠IgG-HRP(RabbitAnti-mouseIgG-HRP,CodeNo.P0260);均為DAKO公司產(chǎn)品,使用時按照說明書要求稀釋。
4、洗滌液(含0.05%Tween20的PBS):1LPBS中加入Tween-20500μL.
5、封閉液(含1%牛血清白蛋白,0.1%Tween20的PBS):10mLPBS中加入100mgBSA,10μLTween-20.
6、底物溶液
①磷酸鈉鹽緩沖液(0.1mol/LpH6.0):稱Na2HPO4·12H2O2.2g,NaH2PO4·2H2O6.84g,用蒸餾水溶解,定容至500mL.
②TMB貯液:稱60mgTMB溶于10mL二甲基亞砜中,4℃避光保存。
③底物應(yīng)用液:現(xiàn)用現(xiàn)配,磷酸鈉緩沖液10mL,TNB貯液10μL.30%H2O215μL,混勻。
7、終止液:2mol/LH2SO4
四、操作步驟
①抗原包被:兔抗人IgG作為抗原,用包被液l:8000稀釋,100μL/孔加入聚苯乙烯96孔反應(yīng)板
中。4℃放置過夜。
②洗滌:次日傾去凹孔內(nèi)的液體,洗滌液洗3次。
③封閉:加l00μL/孔封閉液,室溫放置0.5h.
④洗滌:用洗滌液洗3次。
⑤加待測樣品(一抗):將含單克降抗體的細(xì)胞培養(yǎng)上清在另-塊板上用PBS連續(xù)稀釋(按照1:2或1:10),100μL/孔加到已包被的板上,每個樣品平行做兩份,PBS或空白培養(yǎng)基作為陰性對照,已知樣品作為陽性對照。加蓋37℃恒溫箱溫育1~2h.
⑥洗滌:用洗滌液洗3次。
⑦加酶標(biāo)抗抗體:兔抗鼠IgG-HRP,用封閉液l:8000稀釋,100μL/孔,加蓋37℃恒溫箱溫育1h。
⑧洗滌:用洗滌液洗5次,蒸餾水洗2次。
⑨顯色:加新鮮配制的底物溶液100μL/孔,室溫暗處放置5~30min,顯示藍(lán)色。
⑩終止反應(yīng)、比色:加50μL/孔終止液。顏色變黃;用酶標(biāo)儀測定450nm處各孔的吸光值,陽性反應(yīng)的稀釋度為待測樣品的效價。
原創(chuàng)作者:上海恒遠(yuǎn)生物技術(shù)發(fā)展有限公司
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