分離純化的基本原理 ：

研究基因的表達(dá)和調(diào)控時(shí)常常要從組織和細(xì)胞中分離和純化RNA。RNA質(zhì)量的高低常常影響cDNA庫(kù)，RT-PCR和Northern Blot等分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的成敗。

     TRIzol試劑是一種新型總RNA抽提試劑，適用于從細(xì)胞和組織中快速分離RNA。內(nèi)含異硫氰酸胍等物質(zhì)，能迅速破碎細(xì)胞，抑制細(xì)胞釋放出的核酸酶。TRIzol試劑有多組分分離作用，與其他方法如硫氰酸胍/酚法、酚/SDS法、鹽酸胍法、硫氰酸胍法等相比，特點(diǎn)是可同時(shí)分離一個(gè)樣品的RNA\\DNA\\蛋白質(zhì).TRIzol使樣品勻漿化，細(xì)胞裂解，溶解細(xì)胞內(nèi)含物，同時(shí)因含有RNase抑制劑可保持RNA的完整性。在加入氯仿離心后，溶液分為水相和有機(jī)相，RNA在水相中。取出水相用異丙醇沉淀可回收RNA；用乙醇沉淀中間層可回收DNA；用異丙醇沉淀有機(jī)相可回收蛋白質(zhì)。

操作步驟：

1. 勻漿處理：
a.組織處理  將文蛤的各個(gè)組織在液氮中磨碎，每50～100mg組織加入1ml TRIzol，用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過TRIzol體積10℅。
b.單層培養(yǎng)細(xì)胞　直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細(xì)胞，每10cm2面積（即3.5cm直徑的培養(yǎng)板）加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細(xì)胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA受到DNA的污染。
c.細(xì)胞懸液離心收集細(xì)胞，每5～10×106動(dòng)物、植物、酵母細(xì)胞或1×107細(xì)菌細(xì)胞加入1mlTRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細(xì)胞以免mRNA降解。一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞需用勻漿儀處理。

2.將勻漿樣品在室溫（15～30℃）放置5min，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3.由于樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)，因此在2～8℃10000rpm離心1min，取上清。離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時(shí)，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進(jìn)行下一步操作。

4. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml氯仿，劇烈振蕩15s，室溫放置3分鐘。

5. 2-8℃10000rpm離心15min。樣品分為三層：底層為黃色有機(jī)相，上層為無色水相和一個(gè)中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

6. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機(jī)相，進(jìn)一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1mlTRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10min。

7. 2～8℃10000rpm離心10min，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

8. 用75℅乙醇洗滌RNA沉淀。每使用1ml TRIzol至少加1ml 75℅乙醇。2～8℃不超過7500rpm離心5min，棄上清。

9.室溫放置干燥或真空抽干RNA沉淀，大約晾5～10min即可.不要真空離心干燥，過于干燥會(huì)導(dǎo)致RNA的溶解性大大降低。加入25～200μl無RNase的水或0.5℅SDS，用槍頭吸打幾次，55～60℃放置10分鐘使RNA溶解。RNA可用100℅的去離子甲酰胺溶解，-70℃保存。

10.瓊脂糖凝膠電泳對(duì)提取RNA產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。

原創(chuàng)作者：上海恒遠(yuǎn)生物技術(shù)發(fā)展有限公司