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聯(lián)系人:錢經(jīng)理
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點擊次數(shù):15467 發(fā)布時間:2012/8/8 12:01:52
本試劑盒僅供研究使用
特異性:本試劑盒可同時檢測天然或重組的人血清素/血清胺(ST),且與其他相關(guān)蛋白無交叉反應(yīng)。
有效期:6 個月
預(yù)期應(yīng)用:ELISA 法定量測定人血清、血漿、細(xì)胞培養(yǎng)上清或其它相關(guān)生物液體中血清素/血清胺(ST)含
量。
說明
1.試劑盒保存:-20℃(較長時間不用時);2-8℃(頻繁使用時)。
2.濃洗滌液低溫保存會有鹽析出,稀釋時可在水浴中加溫助溶。
3.中、英文說明書可能會有不一致之處,請以英文說明書為準(zhǔn)。
4.剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會含有少許水樣物質(zhì),此為正,F(xiàn)象,不會對實驗結(jié)果造成任何影響。
實驗原理
用純化的抗體包被微孔板,制成固相載體,往包被抗ST 抗體的微孔中依次加入標(biāo)本或標(biāo)準(zhǔn)品、生物素化
的抗ST 抗體、HRP 標(biāo)記的親和素,經(jīng)過徹底洗滌后用底物TMB 顯色。TMB 在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化
成藍(lán)色,并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成*終的黃色。顏色的深淺和樣品中的ST 呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm 波
長下測定吸光度(OD 值),計算樣品濃度。
試劑盒組成及試劑配制
1. 酶聯(lián)板(Assay plate ):一塊(96 孔)。
2. 標(biāo)準(zhǔn)品(Standard):2 瓶(凍干品)。
3. 樣品稀釋液(Sample Diluent):1×20ml/瓶。
4. 生物素標(biāo)記抗體稀釋液(Biotin-antibody Diluent):1×10ml/瓶。
5. 辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液(HRP-avidin Diluent):1×10ml/瓶。
6. 生物素標(biāo)記抗體(Biotin-antibody):1×120μl/瓶(1:100)
7. 辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素(HRP-avidin):1×120μl/瓶(1:100)
8. 底物溶液(TMB Substrate):1×10ml/瓶。
9. 濃洗滌液(Wash Buffer):1×20ml/瓶,使用時每瓶用蒸餾水稀釋25 倍。
10. 終止液(Stop Solution):1×10ml/瓶(2N H2SO4)。
需要而未提供的試劑和器材
1. 標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格酶標(biāo)儀
2. 高速離心機
3. 電熱恒溫培養(yǎng)箱
4. 干凈的試管和Eppendof 管
5. 系列可調(diào)節(jié)移液器及吸頭,一次檢測樣品較多時,用多通道移液器
6. 蒸餾水,容量瓶等
標(biāo)本的采集及保存
1. 血清:全血標(biāo)本請于室溫放置2 小時或4℃過夜后于1000 x g 離心20 分鐘,取上清即可檢測,或?qū)?biāo)本
放于-20℃或-80℃保存,但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
2. 血漿:可用EDTA 或肝素作為抗凝劑,標(biāo)本采集后30 分鐘內(nèi)于2 - 8° C 1000 x g 離心15 分鐘,或?qū)?biāo)本
放于-20℃或-80℃保存,但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
3. 細(xì)胞培養(yǎng)物上清或其它生物標(biāo)本:1000 x g 離心20 分鐘,取上清即可檢測,或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃
保存,但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
注:標(biāo)本溶血會影響*后檢測結(jié)果,因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項檢測。
標(biāo)本的稀釋原則:
首先通過文獻(xiàn)檢索的方式了解待測樣本的大致含量,確定適當(dāng)?shù)南♂尡稊?shù)。只有稀釋至標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍內(nèi),
檢測的結(jié)果才是準(zhǔn)確的。稀釋的過程中,應(yīng)做好詳細(xì)的記錄。*后計算濃度時,稀釋了“N”倍,標(biāo)本的濃度
應(yīng)再乘以“N”。
標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋原則:2 瓶,每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml,蓋好后靜置10 分鐘以上,然后反復(fù)顛倒/
搓動以助溶解,其濃度為200 ng/ml,做系列倍比稀釋后,分別稀釋200 ng/ml,100 ng/ml,50 ng/ml,25 ng/ml,
12.5 ng/ml,6.25 ng/ml,3.12 ng/ml,樣品稀釋液直接作為標(biāo)準(zhǔn)濃度0 ng/ml,臨用前15 分鐘內(nèi)配制。
如配制100 ng/ml 標(biāo)準(zhǔn)品:取0.5ml(不要少于0.5ml)200 ng/ml 的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含0.5ml 樣品稀釋液的
Eppendorf 管中,混勻即可,其余濃度以此類推。
生物素標(biāo)記抗體的稀釋原則:
臨用前以生物素標(biāo)記抗體稀釋液稀釋,稀釋前根據(jù)預(yù)先計算好的每次實驗所需的總量配制(每孔100μl) ,
實際配制時應(yīng)多配制0.1-0.2ml。如10μl 生物素標(biāo)記抗體加990μl 生物素標(biāo)記抗體稀釋液的比例配制,輕輕
混勻,在使用前一小時內(nèi)配制。
辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素的稀釋原則:
臨用前以辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液稀釋,稀釋前根據(jù)預(yù)先計算好的每次實驗所需的總量配制(每
孔100μl),實際配制時應(yīng)多配制0.1-0.2ml。如10μl 辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素加990μl 辣根過氧化物酶
標(biāo)記親和素稀釋液的比例配制,輕輕混勻,在使用前一小時內(nèi)配制。
操作步驟
實驗開始前,請?zhí)崆芭渲煤盟性噭噭┗驑悠废♂寱r,均需混勻,混勻時盡量避免起泡。每次檢測都
應(yīng)該做標(biāo)準(zhǔn)曲線。如樣品濃度過高時,用樣品稀釋液進(jìn)行稀釋,以使樣品符合試劑盒的檢測范圍。
1. 加樣:分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔。空白孔加樣品稀釋液100μl,余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品
100μl,注意不要有氣泡,加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部,盡量不觸及孔壁,輕輕晃動混勻,酶標(biāo)板加上蓋
或覆膜,37℃反應(yīng)120 分鐘。
為保證實驗結(jié)果有效性,每次實驗請使用新的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。
2. 棄去液體,甩干,不用洗滌。每孔加生物素標(biāo)記抗體工作液100μl(取1μl 生物素標(biāo)記抗體加99μl 生物
素標(biāo)記抗體稀釋液的比例配制,輕輕混勻,在使用前一小時內(nèi)配制),37℃,60 分鐘。
3. 溫育60 分鐘后,棄去孔內(nèi)液體,甩干,洗板3 次,每次浸泡1-2 分鐘,350μl/每孔,甩干。
4. 每孔加辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素工作液(同生物素標(biāo)記抗體工作液) 100μl,37℃,60 分鐘。
5. 溫育60 分鐘后,棄去孔內(nèi)液體,甩干,洗板5 次,每次浸泡1-2 分鐘,350μl/每孔,甩干。
6. 依序每孔加底物溶液90μl,37℃避光顯色(30 分鐘內(nèi),此時肉眼可見標(biāo)準(zhǔn)品的前3-4 孔有明顯的梯度藍(lán)
色,后3-4 孔梯度不明顯,即可終止)。
7. 依序每孔加終止溶液50μl,終止反應(yīng)(此時藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色)。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物液的加入
順序相同。為了保證實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性,底物反應(yīng)時間到后應(yīng)盡快加入終止液。
8. 用酶聯(lián)儀在450nm 波長依序測量各孔的光密度(OD 值)。在加終止液后15 分鐘以內(nèi)進(jìn)行檢測。
注:
1. 用戶在初次使用試劑盒時,應(yīng)將各種試劑管離心數(shù)分鐘,以便試劑集中到管底。
2. 每次實驗留一孔作為空白調(diào)零孔,該孔不加任何試劑,只是*后加底物溶液及2N H2SO4。測量時先用
此孔調(diào)OD 值至零。
3. 為防止樣品蒸發(fā),試驗時將反應(yīng)板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi),酶標(biāo)板加上蓋或覆膜。
4. 未使用完的酶標(biāo)板或者試劑,請于2-8℃保存。標(biāo)準(zhǔn)品、生物素標(biāo)記抗體工作液、辣根過氧化物酶標(biāo)記
親和素工作液請依據(jù)所需的量配置使用。請勿重復(fù)使用已稀釋過的標(biāo)準(zhǔn)品、生物素標(biāo)記抗體工作液或、辣
根過氧化物酶標(biāo)記親和素工作液。
5. 建議檢測樣品時均設(shè)雙孔測定,以保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。
洗板方法
手工洗板方法:吸去(不可觸及板壁)或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體;在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙,酶標(biāo)板朝下
用力拍幾次;將推薦的洗滌緩沖液至少0.3ml 注入孔內(nèi),浸泡1-2 分鐘。根據(jù)需要,重復(fù)此過程數(shù)次。
自動洗板:如果有自動洗板機,應(yīng)在熟練使用后再用到正式實驗過程中。
計算
以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)(對數(shù)坐標(biāo)),OD 值為縱坐標(biāo)(普通坐標(biāo)),在半對數(shù)坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線,
根據(jù)樣品的OD 值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度;再乘以稀釋倍數(shù);或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD 值計算出標(biāo)準(zhǔn)
曲線的直線回歸方程式,將樣品的OD 值代入方程式,計算出樣品濃度,再乘以稀釋倍數(shù),即為樣品的實
際濃度。
注意事項
1. 當(dāng)混合蛋白溶液時應(yīng)盡量輕緩,避免起泡。
2. 洗滌過程非常重要,不充分的洗滌易造成假陽性。
3. 一次加樣時間控制在5 分鐘內(nèi),如標(biāo)本數(shù)量多,推薦使用排槍加樣。
4. 請每次測定的同時做標(biāo)準(zhǔn)曲線,做復(fù)孔。
5. 如標(biāo)本中待測物質(zhì)含量過高,請先稀釋后再測定,計算時請*后乘以稀釋倍數(shù)。
6. 在配制標(biāo)準(zhǔn)品、檢測溶液工作液時,請以相應(yīng)的稀釋液配制,不能混淆。
7. 底物請避光保存。
8. 不要用其它生產(chǎn)廠家的試劑替換試劑盒中的試劑
原創(chuàng)作者:上海恒遠(yuǎn)生物技術(shù)發(fā)展有限公司
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