ELISA試劑盒報(bào)道：

MTT實(shí)驗(yàn)是檢測(cè)細(xì)胞活力的實(shí)驗(yàn)方法，由于細(xì)胞活力與細(xì)胞數(shù)呈正相關(guān)，因此也常常用來(lái)檢測(cè)細(xì)胞的增殖情況。
MTT的原理：活細(xì)胞有琥珀酸脫氫酶，將MTT還原成棕褐色沉淀。由于一般介紹園子里已經(jīng)很多，筆者將自己的心得按照實(shí)驗(yàn)流程與大家交流交流。
1、培養(yǎng)好細(xì)胞點(diǎn)板。
養(yǎng)細(xì)胞沒(méi)啥好說(shuō)的，如果不知道細(xì)胞如何養(yǎng)，那就看看相關(guān)的文獻(xiàn)方法。如果知道了細(xì)胞的名字，就可以上www.atcc.org檢索細(xì)胞的培養(yǎng)信息，這個(gè)網(wǎng)站上的培養(yǎng)方法是標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)方法。當(dāng)然可以根據(jù)自己實(shí)驗(yàn)要求進(jìn)行修改。由于細(xì)胞計(jì)數(shù)很繁瑣，點(diǎn)板時(shí)的細(xì)胞濃度是*難掌握的，這一點(diǎn)筆者的心得如下：
自己先將細(xì)胞養(yǎng)一段時(shí)間，大概了解細(xì)胞的增殖情況，在MTT檢測(cè)時(shí)實(shí)際上要求細(xì)胞大概能長(zhǎng)滿96-孔板的80-90%，如果打算養(yǎng)48小時(shí)就檢測(cè)，根據(jù)細(xì)胞的生長(zhǎng)情況反推點(diǎn)板時(shí)的細(xì)胞濃度狀況。這時(shí)可以將細(xì)胞不進(jìn)行計(jì)數(shù)，將消化好的細(xì)胞混勻后（可能是10 ml）直接在一個(gè)廢棄（進(jìn)行過(guò)無(wú)菌處理）的96孔板中依次加入180、100、50微升細(xì)胞，將細(xì)胞放置幾分鐘就會(huì)沉到板底了，這時(shí)在顯微鏡下觀察，推測(cè)哪個(gè)孔的細(xì)胞48 h能基本長(zhǎng)滿板底，假設(shè)50 微升的孔比較合適，而點(diǎn)板時(shí)沒(méi)孔需點(diǎn)200 微升，那么就將細(xì)胞濃度再稀釋4倍就可以正式點(diǎn)板了，這時(shí)順便將細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)（因?yàn)閷?shí)驗(yàn)記錄要求寫�。�。這樣就OK了！如果細(xì)胞還太多，將細(xì)胞稀釋4倍后再重復(fù)以上操作。注意：不要過(guò)分信賴細(xì)胞計(jì)數(shù)，因?yàn)榧?xì)胞計(jì)數(shù)的取樣量為20 微升左右，由于顆粒的分布不均勻，代表性是很差的。建議：細(xì)胞計(jì)數(shù)一定要會(huì)，但不要完全依賴它。
點(diǎn)板時(shí)一定要將細(xì)胞消化成單個(gè)細(xì)胞，而且一定要混勻，用排槍，否則，MTT的SD會(huì)狂大！
2、點(diǎn)板布局。
其實(shí)這一點(diǎn)很多人不懈一顧。如果你的細(xì)胞要養(yǎng)48 h或更長(zhǎng)，建議不要吝嗇96-孔板的四周邊孔，這32個(gè)邊孔不能使用，建議加入滅菌PBS以飽和中間64個(gè)孔的水分。因?yàn)榧?xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，邊孔的水分蒸發(fā)很快，培養(yǎng)液及里面的藥物會(huì)出現(xiàn)濃縮現(xiàn)象，細(xì)胞的狀況就復(fù)雜了，有些人稱之為“邊緣效應(yīng)”這些孔的SD也會(huì)狂大，既然如此，不如不用。
3、加MTT。
如果確認(rèn)你考察的藥物沒(méi)有氧化還原性，你可以直接加入MTT溶液（總體積的1/10），如果你沒(méi)有把握，建議在加MTT前換一次液；如果你肯定考察的藥物的氧化還原性很強(qiáng)，比如谷胱甘肽、Vit E、VitC，那建議你用PBS將細(xì)胞洗洗，否則這些藥物會(huì)將MTT還原成棕褐色沉淀，這種效果可能是你不需要的。
4、加入MTT后的反應(yīng)
時(shí)間為3-4h，此時(shí)棄去各孔中的液體在加入200微升的DMSO。為了將沉淀溶解完全，盡可能將水棄除干凈，加入DMSO后在搖床上震搖10min。提醒：如果你的細(xì)胞貼壁不好，此時(shí)的沉淀在棄去液體時(shí)易丟失，因此貼壁不好的細(xì)胞在點(diǎn)板時(shí)記得將96孔板用多聚賴氨酸處理處理，要么在棄液體時(shí)先用甩板機(jī)離心，再輕輕棄去液體。關(guān)于DMSO的量，每孔的體積有點(diǎn)兒差異不干擾檢測(cè)，只要能將沉淀完全溶解就行了。至于DMSO的體積差異不同為什么不影響檢測(cè)值已經(jīng)被數(shù)學(xué)證明了，在此我不多說(shuō)，如果有人不明白我再證明給他看。當(dāng)然為了養(yǎng)成良好的實(shí)驗(yàn)習(xí)慣，DMSO的體積還是一致的好。
5、檢測(cè)MTT。
還原的MTT在460-630均有較好的吸收，如果你的酶標(biāo)儀是濾光片，可以選470 nm左右或630 nm左右的濾光片，如果酶標(biāo)儀有單波長(zhǎng)，你可以在檢測(cè)前掃描一下吸收譜，選用細(xì)說(shuō)波長(zhǎng)檢測(cè)就是了，波長(zhǎng)，大概在550nm附近，必要時(shí)加一個(gè)參比波長(zhǎng)以扣除非特異性吸收。
6、吸收值分析。
在理想的MTT實(shí)驗(yàn)中，如果是細(xì)胞抑制實(shí)驗(yàn)，不加藥物處理組的吸收值應(yīng)該在0.8-1.2左右，太小檢測(cè)誤差占的比例較多，太大吸收值可能已經(jīng)超出線性范圍。這個(gè)原理在朗伯-比爾定律中有解釋。
7、如果你覺(jué)得MTT中出現(xiàn)的問(wèn)題不好解決，那么建議你做CCK-8實(shí)驗(yàn)，原理與MTT相似，但操作上簡(jiǎn)化些，當(dāng)然，費(fèi)用也稍微高一些。

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